Marie est le sixième enfant de François Ier de Médicis (1541–1587), grand-duc de Toscane, et de Jeanne d'Autriche (1548–1578), archiduchesse d'Autriche, fille de Ferdinand Ier du Saint-Empire et d’Anne Jagellon.

Elle passe une enfance triste et solitaire, au palais Pitti car elle est orpheline de mère à 5 ans et de père à 12 ans. Son oncle Ferdinand Ier de Médicis monte sur le trône de Toscane et épouse Christine de Lorraine, petite-fille de la reine de France Catherine de Médicis. Nonobstant son désir de donner un héritier à sa dynastie, il fait donner à ses neveux et nièces orphelins une bonne éducation. Marie apprécie particulièrement les disciplines scientifiques et notamment les sciences naturelles, et se passionnera pour les bijoux, les pierres précieuses.

Proche des artistes de sa Florence natale, elle est formée au dessin par Jacopo Ligozzi, où elle se montre très douée ; elle joue aussi de la musique (chant et pratique de la guitare et du luth), apprécie le théâtre et la danse.

Son frère et sa sœur Anne mourront tous deux très jeunes, il ne lui restera que sa sœur aînée Éléonore qui, quelques années plus tard, sera mariée au duc de Mantoue. Après le mariage de sa sœur, il ne lui restera pour seul compagnon de jeux que son cousin germain Virginio Orsini sur qui elle reporte toute son affection.

La richesse des Médicis attire vers Marie de nombreux prétendants, notamment le comte de Vaudémont, frère cadet de Christine de Lorraine, grande-duchesse de Toscane, mais surtout tante et tutrice de Marie. Mais un parti plus prestigieux se présente, le roi de France Henri IV.

Le mariage de Henri IV avec Marie de Médicis répond avant tout pour le roi de France à des préoccupations dynastiques et financières. En effet, Marie de Médicis est la petite-fille de l’empereur romain germanique Ferdinand Ier, ce qui permet d’assurer légitimement une descendance royale en France. De plus les Médicis, banquiers créanciers du roi de France, promettent une dot d'un montant total de 600 000 écus d'or, ce qui vaudra à la reine le surnom de « la grosse banquière » (expression de sa rivale jalouse, la maîtresse du roi Henriette d'Entragues).

Le contrat de mariage est signé à Paris en mars 1600 et les cérémonies officielles sont organisées en Toscane et en France du mois d’octobre au mois de décembre de la même année : le mariage par procuration a lieu à Florence en l'absence du roi qui a délégué une forte ambassade et son favori Roger de Bellegarde qui « épouse » Marie le 5 octobre dans la cathédrale Santa Maria del Fiore. La future reine quitte Florence pour Livourne le 23 octobre, accompagnée de deux mille personnes qui constituent sa suite, et embarque ensuite pour Marseille qu'elle atteint le 3 novembre suivant. C'est Antoinette de Pons, marquise de Guercheville et dame d'honneur de la future reine, qui est chargée de l'accueillir à Marseille. La marquise a si bien su résister aux projets galants du roi que celui-ci lui a dit « Puisque vous êtes réellement dame d'honneur, vous la serez de la reine ma femme ». À la grande fureur de Marie, elle constate que son époux royal ne s'est même pas déplacé pour l'accueillir. Après son débarquement, Marie de Médicis rejoint Lyon le 3 décembre. Ils se rencontrent enfin le 9 décembre et, après le souper, passent leur nuit de noce. Le 17 décembre, le légat pontifical enfin arrivé, donne sa bénédiction à la cérémonie religieuse du mariage.

Marie de Médicis est rapidement enceinte et met au monde le dauphin Louis le 27 septembre 1601 au grand contentement du roi et du royaume qui attendent la naissance d'un dauphin depuis plus de quarante ans, la précédente femme d'Henri IV n'ayant pas donné d'héritier.

Actuellement le couple est dans une phase extrêmement tendue où le Roi préfère pour le moment accorder ses largesses à ses maîtresses plutôt qu'à son épouse.